Центральная толерантность к аллотрансплантату достигается предварительным введением донорских клеток в ткань тимуса (операция достаточно сложная). В результате тимической селекции созревающие Т-лимфоциты распознают донорские антигены как собственные. С точки зрения применения в клинике, более перспективен подход, основаный на трансфекции (под контролем тканеспецифического промотора) генов, кодирующих синтез молекул МНС донора. Однако в клиническом аспекте наибольшие успехи в данном направлении достигнуты пока еще только при введении донорских клеток фетальной печени плоду in utero — до окончательного становления его собственной иммунной системы. Успехи молекулярной биологии позволяют использовать в качестве трансплантатов клетки-трансфектанты, экспрессирующие продукты определенных структурных генов, необходимые для коррекции метаболических дефектов у реципиентов. В данном контексте перспективным представляется использование фетальных миоцитов, имеющих высокий пролиферативный потенциал. Миоциты плода человека экспрессируют молекулы HLA класса I, но, встраиваясь в миосинцитий реципиента, теряют их и становятся неуязвимыми для аллореактивных Т-лимфоцитов. Еще один перспективный способ защиты клеточных аллотрансплантатов — пересадка под прикрытием” клеток Сертоли, которые экспрессируют и секретируют Fas-лиганд, индуцирующий апоптоз Fas-позитивных клеток. В этом случае несущие Fas-антиген активированные Т-лимфоциты гибнут при контакте с клетками Сертоли, что защищает аллотрансплантат от иммунной деструкции (Сухих и др., 1998). В иммунном отторжении значительная роль принадлежит естественным киллерам, которые подвергают литической атаке донорские клетки с аномально низкой экспрессией молекул HLA класса I. Поэтому для защиты трансплантируемых аллогенных стволовых клеток от естественных киллеров реципиента разрабатываются способы трансфекции гена, кодирующего синтез молекул HLA-G, которые природно экспрессируются на клетках неворсинчатого трофобласта и защищают плод от естественных киллеров матери. Существуют и принципиально иные пути обхода иммунологического надзора, позволяющие использовать клеточную трансплантацию без длительного применения иммунодепрессантов.
Определенное преимущество клеточной трансплантации перед пересадкой органов или тканей заключается в реальной возможности предварительной инактивации или элиминации антигенпредставляющих клеток из трансплантата, что позволяет уменьшить прямое иммунное распознавание аллогенных клеток. Однако вероятность отторжения донорских клеток по непрямому механизму этим не устраняется. Предпринимаются попытки ограничения непрямого пути распознавания путем блокады антиген — специфического иили костимулирующего сигналов, поскольку неадекватная информационная поддержка комплекса TCRCD3 приводит к элиминации антигенспецифических Т-лимфоцитов, индукции супрессорного звена иммунитета или к антигенспеци — фической Т-клеточной анергии. Непрямой механизм иммунного ответа пробует блокировать с помощью модификации пептидных фрагментов аллоантигенов или прерывания костимуляции с помощью химерного белка GTLA-4Ig, обладающего высоким аффинитетом к молекуле В-7.2 на антигенпредставляющих клетках. Иммунизация аллоантигеном на фоне введения антител к CD4 тоже может создать относительно стабильную ареактивность аллоантигенспецифических Т-клеток вследствие переключения иммунного ответа на Th2, что через цитокины (IL-4) отменяет реакцию аллореактивных Thl-лимфоцитов (иммунный сдвиг). В некоторых случаях эффективной может оказаться блокада взаимодействия молекул клеточной адгезии и их контрлигандов на Т-лимфоцитах, антигенпредставляющих клетках и эндотелии сосудов. Теоретически обоснован и экспериментально апробирован способ индукции периферической толерантности путем подбора компартментов организма, оптимальных для выживания трансплантируемых клеток, как в смысле обеспечения их метаболической активности, так и минимального риска деструктивного воздействия со стороны аллореактивных Т-клеток. Механическая изоляция трансплантируемых клеток предусматривает инкапсуляцию клеточного трансплантата для предохранения иммунного распознавания донорских клеток. Этот способ борьбы с отторжением клеточного трансплантата чаще применяется в эндокринологии, поскольку обеспечивает возможность высвобождения за пределы капсулы секрети — руемых пересаженными клетками гормонов, корригирующих нарушения функции эндокринной системы реципиента. Однако деструкция трансплантата (например р-клеток островков Лангерганса) может происходить и в отсутствие прямого контакта клеток-мишеней с эффекторами за счет диффузии цитотоксических цитокинов (Сухих и др., 1998).
Множество сложных вопросов в области трансплантационной иммунологии породила практика пересадки ГСК в онкогематологии. До сих пор не ясно, каким образом достижение смешанного гемопоэтического химеризма способствует успешной реализации реакции трансплантат против лейкоза” и можно ли при гемобластозах обеспечить полное приживление трансплантата отменой иммуносупрессии и переливанием донорских лимфоцитов? По данным литературы, развитие реакции трансплантат против лейкоза” и ее эффективность зависят от количества введенных донорских клеток и от биологических особенностей патологического клона — наличия антигенов-мишеней на поверхности, скорости деления, появления новых субклонов (Barrett, 1997; Spitzer et al, 2000). Согласно исследованиям И. Демидовой и соавторов (2003), достаточно эффективная реакция трансплантат против лейкоза” возникает в случаях значительного (> 80%) донорского химеризма, то есть тогда, когда эффект толерантности должен был быть максимальным. При этом не удается добиться эрадикации опухолевого клона путем отмены иммуносупрессии иили трансфузий лимфоцитов донора у больных с низкой степенью приживления ГСК и большим объемом опухолевой массы в костном мозге (> 30% бластных клеток). Считается, что в такой ситуации рост опухоли опережает развитие реакции трансплантат против лейкоза”. В то же время у больных с высокой степенью донорского химеризма (> 80%) отмена циклоспорина А позволяет достичь 100% приживления донорских ГСК и полного исчезновения клеток патологического клона. О какой толерантности в данном случае может идти речь? В пользу необходимости сокращения размеров опухолевого клона для реализации реакции трансплантат против лейкоза” свидетельствуют успешные случаи лечения рецидива гемобластозов через 18 месяцев после трансплантации костного мозга с помощью сочетания полихимиотерапии и трансфузий донорских лимфоцитов, тогда как переливание лимфоцитов на фоне развернутого рецидива такого эффекта не дает. Ни у одного из больных, имевших перед трансплантацией более 20% бластных клеток в костном мозге, обеспечить’Полное приживление донорских ГСК с эрадика — цией патологического клона не удалось (Демидова и др., 2003). С другой стороны, после низкодозного кондиционирования при трансплантации костного мозга одной из основных проблем остается реакция трансплантат против хозяина” Результаты экспериментальных исследований вроде бы позволяют связать смешанный гемопоэтический химеризм с меньшей частотой развития этого вида посттрансплантационной иммунной агрессии (Pelot et al., 1999). Предполагалось, что формирующаяся на фоне клеточного химеризма взаимная иммунологическая толерантность препятствует развитию интенсивной реакции трансплантат против хозяина” (Carella et al., 2000). Однако при оценке результатов клинических исследований это не подтвердилось — острая реакция трансплантат против хозяина” развивается у 30-50% больных, перенесших трансплантацию костного мозга после низкодозного кондиционирования (Childs et al., 1999; Storb, 1999; Carella et al, 2000). В некоторых исследованиях реакция трансплантат против хозяина” развивалась более чем у 50% пациентов, причем независимо от степени гемопоэтического химеризма (Демидова и др., 2003). Не следует забывать, что с целью заместительной терапии в клеточной трансплантологии чаще всего используются алло — генные клетки, что предопределяет необходимость преодоления барьера гистонесовместимости (Сухих и др., 1998). Отторжение клеточных аллотрансплантатов, так же, как и пересаженных органов, реализуется по механизмам прямого представления антигена с участием CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, рестриктированных по молекулам HLA, — Т-лимфоциты реципиента распознают молекулы МНС на антигенпредставляющих клетках донора. В случае непрямого распознавания чужеродных антигенов, наоборот, анти — генпредставляющие клетки реципиента процессируют антигены клеток донора в контексте собственных молекул HLA класса II. Интенсивность реакции отторжения клеточного трансплантата зависит прежде всего от прямого распознавания аллоантигенов, экспрессируемых клетками аллотрансплантата. Поэтому клинические проявления отторжения (неприживления) клеточного трансплантата, не экспрессирующего молекул HLA (или, по крайней мере, молекул HLA класса II), и также неспособного к передаче костимуляторного сигнала аллореактивным Т-лимфоцитам хозяина, минимальны или вообще отсутствуют. В онкогематологии исключение составляет аллотрансплантация ГСК в миелоаблатив — ных режимах, когда неприживление пересаженных клеток приводит к гибели больного, но в заместительной клеточной терапии отторжение стволовых клеток клинически проявляется лишь отсутствием ожидаемого эффекта лечения.
Среди Российских протоколов клинических исследований, посвященных оценке эффективности методов клеточной терапии при ишемической болезни сердца, целесообразно выделить следующие. Протокол NMSC SC-11: аортокоронарное шунтирование + трансплантация с интрамуральным введением ГСК Протокол NMSC SC-22: аортокоронарное шунтирование + трансплантация с внутривенным введением ГСК. Протокол NMSC SC-33: аортокоронарное шунтирование + + G-CSF или GM-CSF. Протокол NMSC SC-44: трансплантация аутологичных ГСК при инфаркте миокарда с интрамуральным введением ГСК в периинфарктную зону. Протокол NMSC SC-55: трансплантация аутологичных ГСК при инфаркте миокарда с внутривенным введением ГСК. Протокол NMSC SC-66: стандартная терапия инфаркта миокарда + G-CSF или GM-CSF (Шевченко, 2003). В коротком резюме следует отметить, что гемопоэтические стволовые клетки относятся к группе регионарных мультипотентных стволовых клеток и отличаются относительной простотой выделения при высоком терапевтическом потенциале. Широкомасштабные клинические испытания трансплантации ГСК установили их высокую эффективность в лечении наследственной и приобретенной гематологической, онкологической и иммунной патологии (Петренко, Грищенко, 2003). Показано, что гемопоэтические стволовые клетки характеризуются способностью почти к неограниченному самоподдержанию и дифференцировке по всем направлениям гемопоэза с образованием зрелых форменных элементов крови. Коммитирование ГСК дает начало неоднородной популяции клеток-предшественников, отличающихся по пролиферативному и дифференцировочному потенциалу (пул поли-, би — и унипотентных клеток), программа развития которых ограничена специализированными клеточными линиями (Ватутин и др., 2003). Успехи молекулярной и клеточной биологии способствовали созданию новых медицинских технологий лечения с помощью ГСК иммунодефицитных состояний, нарушений гемопоэза, болезней печени, сердца, мышечных дистрофий, дегенеративных заболеваний нервной системы, патологии репродуктивной системы, костной, хрящевой и покровных тканей (Сухих и др., 1998). Однако трансплантация ГСК, как и стволовых клеток других типов, находится в самом начале своего клинического применения и окружена теми же проблемами, что и регенеративно-пластическая медицина в целом.5.9. Вместо заключения Тридцать пять лет назад впервые была выполнена пересадка костного мозга человеку. Тогда за отсутствие представлений о значении иммунологического несоответствия клеток донора и реципиента расплачиваться приходилось жизнью больного, погибающего от реакции трансплантат против хозяина” или из-за неприживления трансплантата. Открытие главного комплекса гистосовместимости, в состав которого входят лейкоцитарные антигены человека, и совершенствование способов их типирования позволило добиться высокой выживаемости после трансплантации костного мозга, что способствовало широкому распространению этого метода терапии в гематологии. Сегодня в печати появилось огромное количество сообщений об использовании в клинике для лечения самых разнообразных заболеваний способности стволовых клеток дифференцироваться в клетки различных типов тканей. Однако уменьшение размера трансплантата (от органа и ткани — до клетки) вовсе не отменило законы иммунологии. В клеточной трансплантологии, независимо от источника стволовых клеток, как и при пересадке органов, остается открытой проблема отторжения трансплантата и реакции трансплантат против хозяина” Различия между механизмами отторжения трансплантата органа и клеток исключительно внешние: отторожение пересаженного органа (почки, печени, сердца) заканчивается смертью больного, тогда как отторжение клеток происходит без особой клинической манифестации. Попытки связать иммунологию клеточной трансплантации с отсутствием на поверхности пересаживаемых клеток молекул МНС несостоятельны, поскольку в процессе дифференцировки стволовых клеток антигены МНС экспрессируются неизбежно. Клеточный химеризм, которому приписывается основная роль в индукции толерантности при трансплантации стволовых клеток, по нашему глубокому убеждению, не причина, а следствие иммунологической толерантности.
Развитие клеточных технологий в кардиологии, как и в других областях клинической медицины, — сложный и многоэтапный процесс, предполагающий конструктивное сотрудничество большого количества научных и клинических центров и международного сообщества. При этом особого внимания заслуживают вопросы научной организации многоцентровых исследований в области клеточной терапии. Наиболее важными из них являются разработка протоколов клинических исследований, контроль достоверности клинических данных, формирование национального регистра исследований, интеграция в международные программы многоцентровых клинических исследований, дальнейшее развитие исследований и внедрение результатов в клиническую практику. Основные направления клеточной терапии в кардиологии могут быть сформулированы следующим образом: замещение погибшего миокарда; стимуляция гипертрофии миокарда и ангиогенеза; замещение пейсмекерной функции (создание клеточного водителя ритма); протекция от необратимого ишемического повреждения кардиомиоцитов (Шевченко, 2003). Реальной альтернативой трансплантации клеток может служить методика стимуляции выработки и выброса в кровоток из костного мозга аутологичных ГСК при помощи ростовых факторов — G-CSF и GM-CSF. Предполагается, что достаточно большое количество ГСК, мобилизированных в кровоток из собственного костного мозга больного, создаст необходимую концентрацию клеток-трансформеров в рубцовых зонах, что будет способствовать регенерации кардиомиоцитов и восстановлению поврежденного миокарда. Эта методика не требует проведения операции или сложного инвазивного вмешательства (Беленков и др., 2003). Не менее актуален в кардиологии вопрос о культивировании и использовании протективных свойств эндотелиоцитов. Клетки эндотелия, испытывая большую нагрузку во время реализации сердечного цикла, обладают повышенной способностью к регенерации. Более того, они хорошо культивируются и в перспективе могут быть использованы для производства биокомпозитных сосудистых протезов нового поколения и биопротезов клапанов сердца. Международный опыт применения клеточных технологий в кардиологии позволяет считать данное направление весьма перспективным. Вместе с тем нельзя не отметить, что к настоящему моменту данных, позволяющих рекомендовать методы клеточной терапии для широкого внедрения в повседневную клиническую практику, недостаточно. Необходимы хорошо продуманные и качественно выполненные клинические исследования, целью которых было бы определение эффективности различных вариантов клеточной терапии при ишемической болезни сердца, разработка показаний и противопоказаний к использованию данного метода, создание рекомендаций по комбинированию методов клеточной терапии с традиционными хирургическими и консервативными подходами к лечению ишемической болезни сердца (Шевченко, 2003).